Model experimental porcin de transplant mono-pulmonar stâng ortotopic

Introducere
Modelul porcin este deseori folosit în studiul experimental al transplantului pulmonar, datoritã similitudinii anatomice cu fiinta umanã, usurintei tehnice de realizare datoritã dimensiunilor mari ale animalului, atât din punct de vedere chirurgical, dar si anestezic, usurinta si costurile scãzute de procurare a animalului (1-3).
În studiul de fatã, având în vedere utilitatea modelului porcin ca unealtã de lucru în studiile experimentale de transplant pulmonar, ne-am propus douã obiective:
1. realizarea modelului anestezico-chirurgical de transplant pulmonar porcin;
2. parcurgerea curbei de învãtare a procedurii tehnice de transplant pulmonar.
Aceste obiective sunt elementele cheie în realizarea tehnicã a transplantului pulmonar. Stãpânirea acestor tehnici permite pregãtirea chirurgicalã a experimentatorilor astfel încât, aspectele de manualitate si traning chirurgical si anestezic, sã nu fie surse de complicatii prin ele însele.

Material si Metodã
În acest studiu, au fost folositi 40 de porci domestici, femele, cu greutate între 25 si 30 de kilograme, pentru realizarea a 20 de proceduri de transplant mono-pulmonar stâng ortotopic. Toate animalele au primit îngrijirile stipulate în Conventia Europeanã de Îngrijire a Animalelor, precum si cele prevãzute în “Îngrijirea Animalului de Laborator“ si în “Ghidul de Utilizare si Îngrijire a Animalelor de Laborator" ale Institutului de Resurse ale Animalului de Laborator, publicate de Institutul National de Sãnãtate (Revista NIH nr. 96-03, revizuit 1996).
Animalele au fost împãrtite în douã grupuri: Grupul A, 20 animale, donatori si Grupul B, 20 animale, primitori.
Prelevarea si implantarea grefonului pulmonar s-a realizat succesiv, în aceeasi sala operatorie.

Tehnica operatorie
Intubatia si anestezia
Toate animalele au fost premedicate prin injectare nivelul coapsei membrului posterior de - Ketamina 25 mg/kgc, Midazolam 0,1 mg/kgc si Atropina 0.01 mgkgc.
Inductia anestezicã s-a realizat prin administrare de Propofol 3 - 5 mg/kgc iv periferic, în vena marginalã a urechii. Intubatia a fost oro-trahealã cu sonda endotrahealã cu lumen simplu - 7 mm, în cazul donatorilor si intubatie orotrahealã selectivã selectivã dreaptã cu acelasi tip de sondã împinsã pânã în dreapta, în cazul primitorilor. Pentru mentinerea anesteziei s-a folosit Halotane 1 MAC, Fentanyl 0,2 mg/kgc, Rocuronium 0,6 mg mg/kgc + 0,5 mg/kgc bolus la fiecare 30 minute. S-au monitorizat: la donator SaO2, presiunea inspiratorie si alura ventricularã, la primitor s-a monitorizat în plus presiunea venoasã centralã, presiunea arterialã invazivã prin montare de cateter arterial în artera femuralã si diureza prin cateterizare vezicalã. S-a folosit un ventilator de tip NC-4 (Industria Tehnico-Medicala Bucuresti) iar parametrii de ventilatie au fost: FR = 30 /min VT = 6 ml FiO2 = 0,5.
Antibioprofilaxia s-a realizat prin administrarea a 1g Cefazolin, heparinarea prin 300 UI/Kgc si s-au administrat, atât la donator cât si la primitor, câte 250 mg Metilprednisolon înainte de canularea arterei pulmonare, respectiv înainte de reperfuzie.
Operatia la donator si prepararea grefonului pulmonar
Animalul a fost pozitionat în decubitus dorsal si s-a practicat sternotomie medianã. Dupã îndepãrtarea tesutului timic, s-a deschis cavitatea pericardicã. S-au izolat si lãtuit venele cave, artera pulmonarã si aorta (fig. 1). S-a introdus un cateter de flush arterial în artera pulmonarã stângã, care s-a clampat proximal. Dupã clamparea venelor cave si sectionarea urechiusii stângi, s-a realizat un flash arterial cu solutie salinã fiziologicã hipotermicã (4-8°C) (fig. 2). S-a prelevat apoi blocul cord-pulmon prin sectionarea venelor cave, aortei ascendente si a traheei dupã semi-inflatie pulmonarã si clamparea acesteia.

Blocul cord-pulmon a fost depus într-un recipient cu gheatã sterilã si disecat pentru a preleva grefonul pulmonar stâng. S-a disecat trunchiul arterial si s-a sectionat la origine artera pulmonarã stângã. S-a disecat atriul stâng si a fost sectionat pe linia medianã, pãstrând un colet atrial generos în jurul trunchiului venos stâng (Fig. 3). S-a disecat, ligaturat si sectionat vena lobului caudal (Fig. 4 A, B). S-a clampat si sectionat la origine bronsia primitivã stângã (Fig. 5). În sfârsit, s-a separat plãmânul stâng din blocul cord pulmon si a fost conservat în solutie salinã fiziologicã la 4-8°C.

Operatia la primitor
Animalul a fost pozitionat în decubitus lateral drept si s-a practicat toracotomie postero-lateralã stângã, în dreptul vârfului omoplatului. În primul timp operator s-a practicat pneumonectomie stângã extrapericardicã, cu sectionarea bronsiei la originea lobarei superioare. S-a deschis apoi pericardul si s-a disecat artera pulmonarã la origine, s-a disecat trunchiul venos stâng pânã la vãrsarea în atriu si s-a eliberat urechiusa stângã prin disectia si sectionarea venei azygos stângi.
Grefonul pulmonar a fost apoi plasat în cavitatea toracicã si s-a pregãtit prin sectionarea bronsiei (Fig. 6 A, B), ajustarea lungimii bontului arterial pentru a evita kinkingul dupã anastomozã si pregãtirea anastomozei venoase prin sectionarea excesului de tesut atrial.

Reimplantarea grefonului s-a început cu anastomoza bronsicã, prin surjet cu fir monofilament de polydioxanona 4-0 (Fig. 7). Anastomozele arterialã (Fig. 8) si venoasã (Fig. 9 A, B) s-au realizat prin surjet cu fir monofilament de polypropylena 5-0. S-a realizat o purjare anterogradã si plãmânul a fost repus în circulatie. Cavitatea toracicã a fost drenatã cu un tub de dren si închisã în straturi anatomice.

Evaluarea
S-au înregistrat: timpul de intubatie oro-trahealã si instalare a monitorizãrii, timpul de ischemie caldã, timpul de anastomozã bronsicã, timpul de anastomozã venoasã si timpul de anastomozã arterialã.
Fiecare experiment s-a încheiat dupã o perioadã de o orã de supraveghere, prin injectarea unei supradoze de tiopental sodic.
La final, au fost prelevate biopsii din grefonul pulmonar reimplantat, care au fost analizate în microscopie opticã.

Rezultate
Mortalitate
S-au înregistrat 5 decese (25%). Din cele 20 de proceduri propuse, s-a realizat practic un total de 15 proceduri de transplant mono-pulmonar stâng ortotopic. Au decedat trei donatori si doi primitori. Doi donatori au decedat datoritã unor intubatii dificile. Un donator a decedat înainte de heparinare, consecintã a unei manipulãri cardiace inadecvate si în sfârsit, doi recipienti au decedat în timpul anastomozei venoase.
Pentru evaluarea curbei de învãtare si compararea timplor necesari îndeplinirii diverselor manevre si tehnici, am eliminat aceste 5 decese, care au determinat implicit oprirea procedurii de transplant în momente diferite ale acesteia.
Morbiditate
Rata morbiditãtii a fost de 20%. S-au înregitrat 3 complicatii majore si o complicatie minorã. Complicatiile majore au constat din douã stopuri cardiace, unul la un donator dupã heparinizare, astfel încât prelevarea s-a realizat sub masaj cardiac intern si al doilea la un recipient, cu ocazia clampãrii atriului stâng, care a pornit la manevrele de resuscitare. A treia complicatie majorã s-a datorat existentei unei leziuni a parenchimului grefonului pulmonar, neobservatã la prelevare, care a dus la alterarea calitãtii grefonului prin producerea unei atelectazii regionale a acestuia.
Timpul de intubare si instalare a monitorizãrii
Timpul de intubare si instalare a monitorizãrii a fost cronometrat din momentul inductiei anestezice si pânã în momentul începerii instalarii animalului în pozitia chirurgicalã. Prin urmare, acest timp a cuprins: cateterizarea unei vene marginale a urechii, inductia anestezicã, intubatia oro-trahealã propriu-zisã, la donator. La primitor, se adaugã timpul de cateterizare arterialã, cateterizare venoasã centralã si cateterizare vezicalã. Timpul mediu de intubare si instalare a monitorizãrii a fost de 27 minute, cu extreme de 60-15 minute, pentru donator si de 42 de minute, cu extreme de 85-25 minute, pentru primitor. Pentru primele trei experimente la donator, s-a înregistrat un timp mediu de 48 minute, iar la primitor de 73 minute. Urmãtoarele experimente au înregistrat un timp mediu de 21 minute la donator, respectiv 34 minute la primitor (Fig. 10).

Anastomozele
Nu au fost observate tromboze arteriale sau venoase. Toate animalele au avut fluxuri vasculare satisfãcãtoare la nivelul anastomozelor si ventilatie pulmonarã.
Anastomoza bronsicã
Timpul mediu de anastomozã bronsicã a fost de 20 de minute, cu extreme de 25, respectiv 18 minute (Fig. 11).
Anastomoza arterialã
Timpul mediu de anastomozã arterialã a fost de 18 minute, cu limite de 25, respectiv 13 minute (Fig. 12).
Anastomoza venoasã
Timpul mediu de anastomozã venoasã a fost de 28 minute, cu limite de 61, respectiv 20 minute (Fig. 13).
Timpul de ischemie caldã
Timpul de ischemie calda a fost cronometrat din momentul extragerii grefonului din sacul de conservare si pana în momentul repunerii în circulatie. Timpul mediu de ischemie calda, a fost de 96 minute, cu limite de 210 minute, respectiv 66 minute (Fig.14).
Histopatologic
Primele grefoane pulmonare, prezentau un parenchim pulmonar cu spatii alveolare de dimensiuni variabile, continând material eozinofil amorf si celule inflamatorii (limfoplasmocite, polimorfonucleare, rare hematii si macrofage). Septuri interalveolare usor-moderat îngrosate, prin prezenta de infiltrat inflamator polimorf, predominant limfoplasmocitar, proliferare discretã fibro-colagenicã si a numeroase capilare sangvine dilatate, hiperemiate. Desi prezentau un caracter difuz, aceste leziuni erau mai exprimate în ariile peribronsice. Bronsiile medii, mici si bronsiolele prezentau un epiteliu luminal cu modificãri reactive inflamatorii si infiltrat inflamator polimorf intramural (Fig. 15).
Ulterior, aspectul histopatologic în microscopie opticã s-a modificat, parenchimul pulmonar prezentând spatii alveolare cu aspect normal, fãrã continut, septuri interalveolare usor-moderat îngrosate, prin prezenta de minim infiltrat inflamator limfoplasmocitar, proliferare discretã fibro-colagenicã si a numeroase capilare sangvine dilatate, hiperemiate. Aceste leziui prezentau un caracter difuz însã, arborele bronsic îsi conservã arhitectura (Fig. 16).

Comentarii
Primele transplante pulmonare experimentale au fost practicate în lume încã de la începutul secolului trecut (4), dar a fost necesar ca metodele de suturã bronsicã sã se perfectioneze pentru ca experimentele pe animale în acest domeniu sã depãseascã statutul de exceptii.
În 1963, s-a realizat primul transplant pulmonar la om de cãtre James Hardy (5), profesor de chirurgie si seful departamentului la Centrul Medical al Universitãtii din Mississippi, SUA. Pacientul a trãit 18 zile si a decedat prin insuficientã renalã.
De la primele succese ale transplantului cardio-pulmonar la Standford (Statele Unite ale Americii) în 1981 (6) si transplantului monopulmonar la Toronto (Canada) în 1985 (7), transplantul pulmonar s-a dezvoltat rapid pe plan mondial, oferind o solutie terapeuticã pacientilor suferind de hipertensiune arterialã pulmonarã sau de insuficientã respiratorie terminalã.
În prezent, demararea unui program de transplant de organe, presupune punerea la punct a unui model experimental cu ajutorul cãruia, terapeutii interesati în dezvoltarea unui astfel de program, sã se poatã deprinde în primul rând cu problemele puse de aspectele tehnice ale acestei proceduri terapeutice.
Rata mortalitãtii legate de tehnica anestezico-chirurgicalã între anii 1992 si 2006, raportata în Raportul Oficial al Registrului Societãtii Internationale de Transplant de Cord si Plãmân este de 8,2% în primele 30 de zile, 2,7% între 31 de zile si un an si desi mult mai micã, rãmâne de 0,3% la 5 ani. Aceasta, este mult mai ridicatã în centrele în care programul de transplant este la început (8). Toti terapeutii implicati au observat ameliorarea rezultatelor în paralel cu ameliorare curbei personale de învãtare. Majoritatea autorilor sunt de acord cã un numãr de 50 plãmâni transplantati permit o bunã stãpânire a procedurii.
În cazul nostru, mortalitatea înregistratã a fost de 25%. Din cele 5 animale care au decedat, cel putin 4 decese au fost indiscutabil legate de tehnicã si de lipsa de experientã. Primele douã decese s-au produs de altfel chiar la primele douã experimente, consecintã a dificultãtilor de intubatie. În primul caz, sonda de intubatie a lezat traheea si a pãtruns în mediastin. În cel de-al doilea caz, animalul a decedat prin hipoxie, în timpul manevrelor de introducere a sondei de intubatie. Alte douã decese produse în timpul anastomozei venoase, sunt cel mai probabil consecinta a unei clampãri prea generoase a atriului stâng si prin urmare, jenarea returului venos al plãmânului drept. Aceastã situatie se întâlneste mai ales în cazul unor animale prea tinere, la care dimensiunile atriului stâng sunt reduse.
Complicatiile intraoperatorii majore, au fost legate de tehnicã si s-au datorat manipulãrii cardiace inadecvate în douã cazuri si neobservãrii unei leziuni de parenchim pulmonar a grefonului, în cel de-al treilea caz.
În analiza curbei de învãtare a echipei anestezice, atât la donator cât si la primitor, observãm un decalaj între primele trei experimente la care timpul mediu de intubare si monitorizare a fost de 48 minute, respectiv 73 minute si urmãtoarele experimente, la care acest timp a fost de 21 minute, respectiv 34 minute. Acest decalaj se explicã în primul rând prin particularitãtile anatomice ale animalului. Astfel, cateterizarea arterialã s-a realizat la nivelul arterei femurale, care are un calibrul mai mic decât al unei artere radiale umane si este acoperitã de un derm mult mai bine reprezentat si mai putin elastic. Cateterizarea venoasã centralã, s-a realizat la nivelul venei jugulare interne, de calibru mult mai mic decât la om si situatã de cele mai multe ori la distantã fatã de artera carotidã care serveste de reper în evidentierea venei jugulare.
Dacã luãm în considerare si cele douã esecuri de intubatie oro-trahealã, putem afirma cã au fost necesare cinci experimente pentru cunoasterea si adaptarea la particularitãtile anatomice ale animalului.
În ceea ce priveste anastomozele, am remarcat unele particularitãti specifice modelului porcin. Astfel, bronsia primitivã este constituitã din douã arcuri cartilaginoase unite prin douã mici zone membranoase. Aceastã anatomie este favorabilã anastomozei bronsice prin faptul ca lumenul acesteia este în permanentã deschis, diferentele de calibru sunt mai usor de echilibrat, iar anastomoza este mai rezistentã la eventualele tractiuni ce se pot produce prin manipularea grefonului sau la reventilarea acestuia. În practicã, se observã cã pentru anastomoza bronsiei, curba de învãtare a fost foarte rapidã; doar prima anastomozã a durat 25 minute, fatã de o medie de 20 minute pentru celelalte experimente.
Anastomoza arterialã nu pune probleme deosebite. În general, dacã donatorul si primitorul au greutãti similare, diferenta de calibru este minimã. Trebuie totusi acordatã o atentie deosebitã echilibrãrii acestor diferente datoritã faptului cã artera are un diametru redus (5-7 mm) si anastomoza poate deveni stenozantã. Acesta este probabil motivul pentru care observãm cã abia spre sfârsitul experimentelor, curba de învãtare a anastomozei arteriale a atins un echilibru. Având în vedere timpul de 25 de minute necesare efectuãrii anastomozei arteriale la primul experiment si timpul mediu de 14 minute necesar aceleiasi anastomoze în timpul ultimelor cinci experimente, putem afirma cã antrenamentul a permis un câstig mediu de 11 minute la aceastã anastomozã.
În sfârsit, anastomoza venoasã este cu sigurantã cel mai dificil timp operator al transplantului pulmonar la modelul porcin. Dificultãtile sunt de ordin anatomic si încep încã de la pregãtirea atriului stâng al primitorului, deoarece existã o venã azygos stângã ce se varsã în sistemul cav si care traverseazã din stânga în dreapta la nivelul jonctiunii dintre trunchiul venos pulmonar si atiul stâng, de care este stâns aderentã, zona care trebuie eliberatã pentru a putea realiza anastomoza. Un al doile element anatomic defavorabil este vena lobului caudat care se varsã la nivelul venei pulmonare inferioare stângi, în dreptul jonctiunii acesteia cu vena pulmonarã superioarã stângã. În practicã, aceastã venã trebuie ligaturatã la donator si pãstratã la primitor pentru a evita defunctionalizarea lobului caudat, a avea o gurã de anastomozã cât mai largã si mai ales a pãstra o lungime cât mai mare a trunchiului venos la primitor. Dar dificultatea cea mai mare este reprezentatã de dimensiunile reduse ale atriului stâng, ceea ce limiteazã extrem de mult profunzimea la care atriul poate fi clampat, fãra a jena calea de întoarcere venoasã a plãmânului drept. În cazul nostru, acesta a fost de altfel motivul a douã decese si un stop cardiac resuscitat. De cele mai multe ori, dupã clamparea atriului stâng, distanta fatã de marginile de anastomozã este extrem de redusã, în ciuda artificiului de prelungire prin sectionarea puntii dintre cele douã orificii venoase ale trunchiului. Mai mult, datoritã cresterii presiunii în atriul stâng cu ocazia clampãrii acestuia, pensa Satinski poate aluneca fãcând imposibilã continuarea anastomozei. Am fost uneori obligati sã replasam aceastã pensã pentru a putea finaliza anastomoza. Cu toate acestea, dacã analizãm curba de învãtare si comparând cu media ultimelor 5 experimente (21 minute), observãm cã s-au câstigat aproximativ 10-11 minute per ansamblu. Totusi, timpul necesar realizãrii acestei anastomoze rãmâne prelungit.
S-a observat cã prin antrenament se scurteazã timpii necesari efectuãrii diferitelor anastomoze, ceea ce duce în final la scurtarea timpului de ischemie caldã, unul din obiectivele principale ale oricãrei proceduri de transplant (9). În cazul nostru, beneficiul antrenamentului pe model animal este evident. Dacã timpul mediu de ischemie caldã este de 144 minute pentru primele experimente, acesta s-a redus la jumãtate (72,5 minute) pentru urmãtoarele experimente. Consecinta practicã imediatã a fost evidentã în aspectul anatomo-patologic al grefonului pulmonar. Primele grefoane prezentau un important aspect inflamator care s-a redus considerabil la ultimele grefoane analizate.

Concluzii
Am realizat un model experimental de transplant pulmonar la porc ce a permis efectuarea curbei de învãtare de cãtre echipa anestezico-chirurgicalã, ceea ce a dus în practicã la reducerea timpilor necesari efectuãrii diferitelor anastomoze si implicit, timpul total al procedurii si mai ales timpul de ischemie caldã. Este o primã etapã recomandatã înaintea demarãrii clinice a transplantului pulmonar. Totodatã, existenta unui model experimental si a unei echipe anestezico-chirurgicale antrenate permite abordarea unor subiecte de cercetare în domeniul transplantului pulmonar.

Multumiri
Profesorului Doctor Teodor Horvat pentru sprijinul moral pe care, cu generozitate, ni la acordat întotdeauna.

Realizarea acestui proiect a fost posibilã gratie fondurilor acordate de Ministerul Educatiei si Cercetãrii prin intermediul granturilor organizate de cãtre Consiliul National al Cercetãrii Stiintifice din Învãtãmântul Superior.

Bibliografie
1. Kern, J.A., Tribble, C.G., Chan, B.B., Flanagan, T.L., Kron, I.L. - Reduced-size porcine lung transplantation: long-term studies of pulmonary vascular resistance. Ann. Thorac. Surg., 1992, 53:583.
2. Hammainen, P., Taskinen, E., Aarnio, P., Lehtola, A., Heikkila, L., Harjula, A. - Experimental piglet lung transplantation: histological bioptic changes and autopsy findings. APMIS, 1997, 105:909.
3. Kutschka. I., Sommer, S.P., Hohlfeld, J.M., Warnecke, G., Morancho, M., Fischer, S., Haverich, A., Struber, M. - Hannover Thoracic Transplant Program. In-situ topical cooling of lung grafts: early graft function and surfactant analysis în a porcine single lung transplant model. Eur. J. Cardiothorac. Surg., 2003, 24:411.
4. Carrel, A. - Surgery of blood vessels. Bull Hopkins Hosp., 1907, 18:18.
5. Hardy, J.D., Eraslan, S., Dalton, M.L. Jr. - Autotransplan-tation and homotransplantation of the lung: further studies. J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 1963, 46:606.
6. Reitz, B.A., Wallwork, J.L., Hunt, S.A., Pennock, J.L., Billingham, M.E., Oyer, P.E., Stinson, E.B., Shumway, N.E. - Heart-lung transplantation: successful therapy for patients with pulmonary vascular disease. N. Engl. J. Med., 1982, 306:557.
7. Toronto Lung Transplantation Group. Unilateral lung transplantation for pulmonary fibrosis. N. Engl. J. Med., 1986, 314: 1140.
8. The Registry Of The International Society For Heart And Lung Transplantation: Twenty-Fourth Annual Report. J. Heart Lung Transplant, 2007, 26:763.
9. Snell, G.I., Rabinov, M., Griffiths, A., WILLIAM, T., UGOMI, A., SALA MONSSOM, R., ESMORE, D. - Pulmonary allograft ischemic time: an important predictor of survival after lung transplantation. J. Heart Lung Transpl., 1996, 15:160.

• Timeviewed: 3765 times