Biofilme peritoneale: caracteristici microscopice

Introducere
Infectiile intraabdominale se caracterizeazã microscopic prin popularea microbianã rapidã a peritoneului si prin reactia standard de limitare a focarului infectios cu depuneri fibrinice si recrutarea celulelor imune pentru combaterea germenilor infectiosi. Privind colonizarea peritonealã prin prisma conceptiei microbiolgice de biofilm putem presupune cã proprietãtile deosebite ale biofilmelor peritoneale sunt cauza persistentei procesului infectios in cadrul peritonitelor severe.
Culturile microbiene fixate pe suprafete biotice sau abiotice încapsulate în matrice din exopolizaharide se numesc biofilme (1, 2). Pentru prima datã notiunea de biofilm a apãrut în 1978 (3) si deja primele studii de biofilme au demonstrat rezistenta lor considerabilã la germicide si antibiotice. Concentratiile minime de inhibitie (CMI) pentru biofilm au fost de la 50 la 500 de ori mai mari decât cele pentru culturi planctonice, (4) s-a observat cresterea secretiei de exopolimere dupã expunerea la biocide, ceea ce face biofilmul si mai rezistent.(5)
În patologia umanã prezenta biofilmelor a fost demonstratã în multe patologii infectioase cronice: fibroza chisticã, osteomielita, prostatitã, pielonefritã, în care ei sunt factorul ce determinã infectia persistentã si recurentã si, prin urmare, evolutia si pronosticul bolii.(6-10) Aparitia bio-filmelor pe suprafete sintetice explicã infectiile persistente, legate de dispozitivele medicale implantabile (catetere intraperitoneale, intravenoase, urinare, stenturi biliare, valve cardiace artificiale, proteze vasculare etc)(11-12).
În patologia infectioasã acutã prezenta biofilmelor si importanta lor clinicã nu au fost studiate suficient pânã în prezent. Infectiile intraabdominale severe provocate de flora intestinalã mixtã sunt un exemplu de o patologie infectioasã acutã, de importantã socio-medicalã majorã, datoritã mortali-tãtii înalte si daunelor economice considerabile. Colonizarea bacterianã a peritoneului a fost studiatã în trecut, dar fãrã analiza cronologicã a acestui fenomen.
În lucrarea datã am studiat evolutia în timp a formãrii biofilmelor peritoneale în decursul PAD folosind material experimental si clinic.

Material si Metodã
Experientele raportate în acest articol au fost efectuate în conformitate cu principiile expuse în ghidul de îngrijire si folosire a animalelor de laborator (13). Acest studiu a fost aprobat de Societatea Bioeticã a Universitãtii de Stat de Medicinã si Farmacie "N.Testemitanu".
Ligaturarea si Punctia Cecului (LPC) a fost aleasã ca model experimental de peritonitã fiind cel mai apropiat de situatia clinicã realã, realizând o peritonitã severã perforativã cu influx intermitent a florei intestinale în cavitatea peritonealã (14, 15). soarecii maturi Swiss Webster au fost tinuti în vivariul universitar la 12/12 ore ciclu de luminã/întuneric. Au fost acomodati 2 zile înainte de interventie. Hrana si apa au fost accesibile ad libitum, cu exceptia perioadei postoperatorii precoce.
Metoda LPC
Animalele au fost anesteziate cu 80 mg/kg ketaminã (Holden) si 16 mg/kg xilazinã hidroclorid (Rompun, Bayer AG) intramuscular. LPC letalã (mai mult de 80% din cec legat, impunsãturã transfixiantã cu acul 18G) a fost efectuatã conform protocolului descris în alte publicatii (16).
Animalele au fost divizate în 4 grupe: eutanaziati dupã 10 ore de observatie postoperatorie, dupã 24 ore, dupã 48 ore si 72 ore respectiv (în total 20 animale). soarecii, care au murit pânã la termen din cauza peritonitei severe au fost exclusi din studiu. Mostrele de peritoneu parietal cu stratul muscular subiacent si portiuni de oment au fost colectate si plasate în solutie de glutaraldehidã de 5%.
Specimenele de peritoneu uman au fost obtinute intraoperator de la 10 pacientii cu PAD la 48-72 ore de la debutul bolii si studiate microscopic si ultramicroscopic.
Microscopie
Specimenele colectate au fost fixate cu glutaraldehidã în 0,1M bufer fosfat. Postfixarea a fost efectuatã în solutie 1% osmium tetraoxid. Sectiunile ultrafine de portiuni selectate au fost produse cu Tesla BS-490A si apoi contrastate cu acetat de uraniu si citrat de plumb. Pentru examinarea sectiunilor a fost folosit micorscopul electronic de transmisie JEM-100SX.

Rezultate
În primul grup (10 ore dupã LPC) au fost observate bacterii solitare si neutrofile polimorfonucleare în depunerile de fibrinã pe peritoneul visceral si parietal (fig. 1).
În al doilea grup de soareci eutanasiati la 24 ore dupã LPC în portiunele studiate au fost depistate agregate de bacterii în proces de multiplicare activã la nivelul seroasei distruse. S-a început excrectia de polimere extracelulare. Aceste biofilme sunt încã tinere, deoarece nu au acumulat cantitatea suficentã de glicocalix (fig. 2).
În al treilea grup de soareci (48 ore dupã LPC) noi am stabilit microscopic si ultramicroscopic avansarea procesului infectios în cavitatea peritonealã. Coloniile bacteriene se rãspândesc prin septurile de tesut conjunctiv în straturile musculare a peretelui abdominal. Asa cum este caracteristic pentru un biofilm matur matricea exopolizaharidicã ocupã mai mult loc decât celulele (mai mult de 50% din volumul biofilmului). Bacteriile continuã sã se dividã (fig. 3 a, b).
Numai douã animale din al patrulea grup au supravietuit 72 ore dupã o LPC letalã. În aceste cazuri tabloul ultramicroscopic al specimenelor peritoneale este asemãnãtor cu cel din al treilea grup, dar cu o rãspândire mai adâncã în stratul muscular. Pe unele microfotografii se observã distrugerea miofilamentelor prin invazie bacterianã. În acest grup noi am reusit sã observãm bacterii, care continuã sã se multiplice, fixate în lumenul unui vas sanguin (fig. 4).
Biofilmele din specimenele peritoneale prelevate de la pacienti corespund cu acelea de la soareci la 48 si 72 ore dupã LPC, dar invazia bacterianã peritonealã este mai superficialã, probabil datoritã unui peritoneu mai gros si peritonitei mai putin agresive. Dupã microfotografii nu putem determina speciile microbiene, dar putem afirma cã aceste biofilme sunt polimicrobiene: pe imagine se vãd atât coci, cât si bacili (fig. 5).

Discutii
În infectiile intraabdominale cantitatea si virulenta micro-organismelor prevaleazã posibilitãtile de epurare naturalã prin rezorbtia limfaticã si fagocitozã. Colonizarea microbianã a mezoteliului are loc rapid si reflectã cronologia clasicã de formare a biofilmului. Fixarea reversibilã prin legãturi electrostatice are loc în câteva minute; câteva ore sunt necesare pentru formarea legãturilor chimice stabile (fixarea ireversibilã), începerea diviziunilor celulare si sinteza de exopolimere. La colonia formatã aderã alte specii (colonizarea secundarã). În câteva zile apare un biofilm matur, integrat într-o matrice exopolizaharidicã groasã, alcãtuitã din specii selectate de microorganisme (17, 18). Aceastã matrice tine celulele bacteriene împreunã si le protejeazã de antibiotice si biocide. De asemenea matricea functioneazã ca un sistem de schimb de ioni, care asigurã aprovizionarea cu nutrienti si înlãturarea de deseuri (19). Excretia de exopolizaharide este semnul de transformare bacterianã din fenotipul flotant în fenotipul fixat - biofilm (20). În studiul nostru deja peste 48-72 ore dupã LPC biofilmele obtin o matrice groasã, care ocupã mai mult de 50% din volumul coloniei.
Antibioticele rãmân unul din instrumentele clinice efective în tratamentul infectiilor intraabdominale severe. Pe fondalul antibioticoterapiei agresive si lavajului peritoneal continuu dispar bacteriile flotante din lichidul peritoneal, dar biofilmul bacterial se rãspândeste în straturile peritoneale mai profunde si se acoperã cu o matrice mai groasã, populând concomitent si tuburile de drenaj intra-abdominale.(11) Dacã pacientul supravietuieste o perioadã mai lungã, însãmântãrile repetate ale lichidului peritoneal devin fictive, deoarece nu reflectã corect spectrul bacterian si concentratia realã de germeni din focarele de inflamatie intraperitonealã (21-23).
Dozele terapeutice de antibiotice se calculeazã reiesind din CMI si CMB obtinute pe culturi bacteriene proaspete flotante. Schemele de antibioterapie folosite în tratamentul pacientilor cu peritonite difuze, bazate pe CMI-uri pentru bacterii flotante nu asigurã eradicarea biofilmelor peritoneale.
Majoritatea autorilor raporteazã susceptibilitatea micã a biofilmelor fatã de agentii, care combat bacteriile "plancto-nice" folosind diferite sisteme experimentale pentru obtinerea biofilmelor (24-29). Aparatul lui Robbin modificat a fost folosit în multe studii de biofilme, prezentând rezultate reproductibile (24, 25), dar având unele dezavantaje a fost înlocuit cu sistemele comerciale cum sunt Biofilm Reactor sau MBEC-assay. Determinarea Concentratiei Minime de Eliminare a Biofilmului (CMEB) folosind MBEC-assay, sau asa-numitã instalatie din Calgary, a fost efectuatã pentru multe culturi bacteriene de referintã si clinice fatã de majoritatea agentilor antimicrobieni cunoscuti. Pentru E.coli MBEC-urile obtinute în aceste studii la testarea ampicilinei, ciprofloxacinei, cefazolinei, cefotaximei si trimetoprim-sulfometoxazolului sunt de peste 1000 de ori mai mari decât concentratiile inhibitorii pentru culturile flotante. Din grupul preparatelor testate tobramicina a fost cea mai eficientã pentru eliminarea biofilmului de E.coli. CMI-urile determinate prin aceastã metodã corespund cu acele determinate prin intermediul metodelor standard NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) (26, 27).
Metodele standardizate de determinarea a CMEB in vitro permit testarea noilor preparate antibacteriene si examinarea celor, care se folosesc în practica medicalã, pentru aprecierea activitãtii lor fatã de biofilmele microbiene.
O altã optiune terapeuticã este combinarea antibioticelor cu agenti care inhibã dezvoltarea biofilmului. Cu acest scop enzimele proteolitice au fost folosite în infectiile protezelor vasculare si în peritonite la pacienti cu dializa peritonealã continuã (28-30). În Clinica de chirurgie, Universitãtii de Stat de Medicinã si Farmacie "N. Testemitanu" o perioadã îndelungatã de timp cu succes este folositã combinatia antibiotic/enzimã proteoliticã în tratamentul local al PAD (31, 32).
Formarea biofilmelor asadar este caracteristicã nu numai pentru infectiile cronice, ci si pentru cele acute. Astfel putem presupune cã coloniile integrate în matricea polimericã apar în orice focar infectios în primele 24-48 ore de la debutul bolii ca o formã naturalã de existentã a microorganismelor fixate pe peritoneu.

Concluzii
1. Studiul a stabilit cã în evolutia peritonitelor generali-zate secundare experimentale biofilmele peritoneale apar precoce, în primele 24 ore.
2. Datele clinice si experimentale demonstreazã cã peste 48-72 ore de la debutul bolii se formeazã un biofilm peritoneal matur multistratificat polimicrobian.

Multumiri
Acest studiu a fost efectuat cu suportul Universitãtii de Stat de Medicinã si Farmacie "N. Testemitanu", Chisinãu, Moldova.

Bibliografie
1. POTERA, C. - Biofilms invade microbiology. Science, 1996, 273:1795.
2. STOODLEY, P., SAUER, K., DAVIES, D., COSTEROM, J.W. - Biofilms as complex differentiated communities. Annu. Rev. Microbiol., 2002, 56:187.
3. COSTERTON, J., GEESEY, G., CHENG, K. - How bacteria stick. Sci. Am., 1978, 238:86.
4. GANDER, S. - Bacterial biofilms: Resistance to antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother., 1996, 37:1047.
5. ANDERSON, R., HOLLAND, B., CARR, J., BOMD, W.W., FAVERO, M.S. - Effect of disinfectants on Pseudomonas colonized on the interior surface of PVC pipes. Am. J. Public. Health., 1990, 80:17.
6. LAM, J., CHAN, R., LAM, K., COSTEROM, J.W. - Produc-tion of mucoid microcolonies by Pseudomonas aeruginosa within infected lungs in cystic fibrosis. Infect. Immun., 1980, 28:546.
7. LAMBE, D., FERGUSON, K., MAYBERRY-CARSON, K. - Foreign-body-associated experimental osteomyelitis induced with Bacteroides fragilis and Staphylococcus epidermidis in rabbits. Clin. Orthop. Relat. Res., 1991, 266:285.
8. RAYNER, M., ZHANG Y., GORRY, M., CHEM, Y., POST, CH., EHRLICH, G. - Evidence of bacterial metabolic activity in culture-negative otitis media with effusion. JAMA, 1998, 279:296.
9. NICKEL, J., COSTERTON, J., MCLEAN, R., OLSOM, M.E. - Bacterial biofilms: influence on the pathogenesis, diagnosis and treatment of urinary-tract infections. J. Antimicrob. Chemother., 1994, 33:31.
10. HA, K., CHUNG, Y., RYOO, S. - Adherence and biofilm formation of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium tuberculosis on various spinal implants. Spine, 2005, 30:38.
11. VAS, S. - Infections related to prosthetic materials in patients on chronic dialysis. Minerva Urol. Nefrol., 2004, 56:259.
12. COSTERTON, J., VEEH, R., SHIRTLIFF, M., PASMORE, M., POST, C., EHRICH, G. - The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. J. Clin. Invest., 2003, 112:1466.
13. National Research Council - Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Ed. National Academy Press, 1996.
14. PARKER, S., WATKINS, P. - Experimental models of Gram-negative sepsis. Br. J. Surg., 2001, 88:22.
15. WICHTERMAN, K., BAUE, A., CHAUDRY, I. - Sepsis and septic shock - a review of laboratory models and a proposal. J. Surg. Res., 1980, 29:189.
16. BAKER, C., CHAUDRY, I., GAINES, H., BAUE, A.E. - Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. J. Surg., 1983, 94:331.
17. MITTELMAN, M. - Biological Fouling of Purified-Water Systems: Part 1, Bacterial Growth and Replication. Micro-contamination, 1985, 3:51.
18. VAN LOOSDRECHT, M., LYKLEMA, J., NORDE, W., ZHENDER, A. - Influence of interfaces on microbial activity. Microbiol. Rev., 1990, 54:75.
19. COSTERTON, J., LEWANDOWSKI, Z., CALDWELL, D., KORBER, DR, LAPPIM-SCOTM, H.M. - Microbial Biofilms. Annual Reviews of Microbiology, 1995, 49:711.
20. GEESEY, G., LEWANDOWSKI, Z., FLEMMING, H. -Biofouling and Biocorrosion in Industrial Water Systems. Ann Arbor: Lewis Publishers, 1994.
21. NYSTROM, P., JOHANSSON, L., LENNQUIST, S. - Intra-operative saline irrigation of the peritoneal cavity in experimental post-traumatic peritonitis. Acta Chir. Scand., 1983, 149:509.
22. SWENSON, R., LORBER, B., MICHAELSON, T, SPAULDING, E.H. - The bacteriology of intra-abdominal infections. Arch. Surg., 1974, 109:398.
23. HAU, T. - Bacteria, toxins, and the peritoneum. World J. Surg., 1990, 14:167.
24. KUMON, H., ONO, N., ILDA, M., NICKEL, J. - Combination effect of fosfomycin and ofloxacin against Pseudomonas aeruginosa growing in biofilms. Antimicrob. Agents Chemother, 1995, 39:1038.
25. MORCK, D., LAM, K., MCKAY S., OLSON, M., PROSSER, B., ELLIS B., CLEELAND, R., COSTERTON, J. - Comparative evaluation of fleroxacin, ampicillin, trimethoprim-sulfamethoxazole, and gentamicin as treatments of catheter-associated urinary tract infections in a rabbit model. Int. J. Antimicrob Agents, 1994, 4:21.
26. CERI, H., OLSON, M., STREMICK, C., READ, R., MORCK, D., BURET, A. - The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol., 1999, 37:1771.
27. CERI, H., OLSON, M., MORCK, D., STOREY, D., READ, R., BURET, A., OLSON, B. - The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide
susceptibility testing. Methods Enzymol., 2001, 337:377.
28. SEPANDJ, F., CERI, H., GIBB, A., READ, R.R., OLSON, M.E. - Minimum inhibitory concentration (MIC) versus minimum biofilm eliminating concentration (MBEC) in evaluation of antibiotic sensitivity of gram-negative bacilli causing peritonitis. Perit. Dial. Int., 2004, 24:65.
29. SELAN, L., BERLUTTI, F., PASSARIELLO, C., COMMODI-BALLANTI, M.R., THALLER, M.C. - Proteolytic enzymes: a new treatment strategy for prosthetic infections? Antimicrob. Agents Chemother., 1993, 37:2618.
30. WORLAND, M., RADABAUGH, R., MUELLER, B. - Intraperitoneal thrombolytic therapy for peritoneal dialysis-associated peritonitis. Ann. Pharmacother., 1998, 32:1216.
31. MALOMAN, E., SYRBU, V., LUPASHKU B. - Effect of proteolytic enzymes on the antimicrobial activity of antibiotics. Antibiotiki, 1975, 20:613.
32. MALOMAN, E. - Diagnosticul si tratamentul peritonitei acute generalizate, Ed. Stiinta (Chisinãu), 1985.

• Timeviewed: 5175 times